Laasigbotitusita Oluyanju PCR: Awọn ibeere Nigbagbogbo ati Awọn ojutu

Awọn olutupalẹ polymerase pq (PCR) jẹ awọn irinṣẹ pataki ninu isedale molikula, gbigba awọn oniwadi laaye lati pọ si DNA fun awọn ohun elo ti o wa lati iwadii jiini si awọn iwadii ile-iwosan. Sibẹsibẹ, bii ẹrọ eyikeyi ti o nipọn, olutupalẹ PCR le ba awọn iṣoro ba pade ti o ni ipa lori iṣẹ rẹ. Nkan yii sọrọ diẹ ninu awọn ibeere ti o wọpọ nipaPCR itupalelaasigbotitusita ati pese awọn solusan to wulo si awọn iṣoro ti o wọpọ.

1. Kini idi ti iṣesi PCR mi ko ṣe alekun?

Ọkan ninu awọn iṣoro ti o wọpọ julọ ti o dojuko nipasẹ awọn olumulo ni ailagbara ti iṣesi PCR lati mu DNA ibi-afẹde pọ si. Eyi le jẹ ikasi si awọn ifosiwewe pupọ:

Apẹrẹ alakoko ti ko tọ: Rii daju pe awọn alakoko rẹ jẹ pato fun ọkọọkan ibi-afẹde ati ni iwọn otutu yo ti aipe (Tm). Lo awọn irinṣẹ sọfitiwia fun apẹrẹ alakoko lati yago fun isomọ ti kii ṣe pato.

DNA Àdàkọ ti ko to: Daju pe o nlo iye DNA awoṣe ti o to. Diẹ diẹ yoo ja si ni ailera tabi ko si ampilifaya.

Awọn inhibitors ninu ayẹwo: Awọn ajẹsara ninu ayẹwo le ṣe idiwọ iṣesi PCR. Gbiyanju lati sọ DNA rẹ di mimọ tabi lilo ọna isediwon ti o yatọ.

Solusan: Ṣayẹwo apẹrẹ alakoko rẹ, mu ifọkansi awoṣe pọ si, ati rii daju pe ayẹwo rẹ ko ni awọn inhibitors ninu.

2. Kini idi ti ọja PCR mi jẹ iwọn ti ko tọ?

Ti iwọn ọja PCR rẹ ko ba jẹ bi o ti ṣe yẹ, o le tọkasi iṣoro kan pẹlu awọn ipo ifaseyin tabi awọn eroja ti a lo.

Imudara ti kii ṣe pato: Eyi le waye ti alakoko ba sopọ mọ aaye airotẹlẹ. Ṣayẹwo pato ti awọn alakoko nipa lilo ohun elo kan gẹgẹbi BLAST.

Iwọn otutu Annealing ti ko tọ: Ti iwọn otutu annealing ba lọ silẹ ju, isọdọmọ ti ko ni pato le ja si. Imudara iwọn otutu annealing nipasẹ PCR gradient.

Solusan: Jẹrisi pato alakoko ati mu iwọn otutu annealing pọ si lati mu ilọsiwaju awọn ọja PCR dara si.

3. Mi PCR analyzer han ohun aṣiṣe ifiranṣẹ. kini o yẹ ki n ṣe?

Awọn ifiranšẹ aṣiṣe lori olutupalẹ PCR le jẹ itaniji, ṣugbọn wọn le pese awọn amọran nigbagbogbo si awọn iṣoro ti o pọju.

Awọn ọran Isọdiwọn: Rii daju pe olutupalẹ PCR ti ni iwọn deede. Itọju deede ati awọn sọwedowo isọdọtun jẹ pataki lati gba awọn abajade deede.

Ẹgbẹ Software: Nigba miiran, awọn aṣiṣe sọfitiwia le fa awọn iṣoro. Tun kọmputa rẹ bẹrẹ ki o ṣayẹwo fun awọn imudojuiwọn sọfitiwia.

OJUTU: Tọkasi itọnisọna olumulo fun koodu aṣiṣe kan pato ki o tẹle awọn igbesẹ laasigbotitusita ti a ṣeduro. Itọju deede le ṣe idiwọ ọpọlọpọ awọn iṣoro.

4. Kini idi ti awọn abajade esi PCR mi ko ni ibamu?

Awọn abajade PCR ti ko ni ibamu le jẹ ibanujẹ fun awọn idi pupọ:

Didara Reagent: Rii daju pe gbogbo awọn reagents, pẹlu awọn enzymu, awọn buffers, ati awọn dNTP, jẹ tuntun ati ti didara ga. Awọn reagenti ti pari tabi ti doti le fa iyipada.

Iṣatunṣe Cycler Gbona: Awọn eto iwọn otutu ti ko ni ibamu le ni ipa lori ilana PCR. Nigbagbogbo ṣayẹwo iwọntunwọnsi ti cycler gbona.

Solusan: Lo awọn reagents ti o ni agbara giga ati ṣe calibrate cycler igbona rẹ nigbagbogbo lati rii daju awọn abajade deede.

5. Bawo ni a ṣe le mu ilọsiwaju iṣeduro PCR dara si?

Imudara ṣiṣe ti awọn aati PCR le ja si awọn eso ti o ga julọ ati awọn abajade igbẹkẹle diẹ sii.

Ṣe ilọsiwaju awọn ipo iṣe: Ṣayẹwo nipa lilo awọn ifọkansi oriṣiriṣi ti awọn alakoko, DNA awoṣe ati MgCl2. Idahun PCR kọọkan le nilo awọn ipo alailẹgbẹ fun iṣẹ ṣiṣe to dara julọ.

Lo awọn ensaemusi iṣootọ giga: Ti iṣedede ba ṣe pataki, ronu nipa lilo polymerase DNA ti o ga-giga lati dinku awọn aṣiṣe lakoko imudara.

Solusan: Ṣe idanwo iṣapeye lati wa awọn ipo ti o dara julọ fun iṣeto PCR rẹ pato.

Ni soki

Laasigbotitusita aPCR itupalele jẹ iṣẹ-ṣiṣe ti o lewu, ṣugbọn agbọye awọn iṣoro ti o wọpọ ati awọn ojutu wọn le ṣe alekun iriri PCR rẹ ni pataki. Nipa didaju awọn iṣoro wọpọ wọnyi, awọn oniwadi le mu awọn abajade PCR dara si ati rii daju awọn abajade igbẹkẹle ninu awọn ohun elo isedale molikula. Itọju deede, yiyan iṣọra ti awọn reagents, ati iṣapeye ti awọn ipo iṣe jẹ awọn bọtini si itupalẹ PCR aṣeyọri.