Awọn ifosiwewe kikọlu ni awọn aati PCR

Lakoko iṣesi PCR, diẹ ninu awọn okunfa idilọwọ ni igbagbogbo pade.
Nitori ifamọ ti PCR ti o ga pupọ, a gba idoti lati jẹ ọkan ninu awọn ifosiwewe pataki julọ ti o kan awọn abajade PCR ati pe o le gbe awọn abajade rere eke jade.
Paapaa pataki ni awọn orisun oriṣiriṣi ti o yorisi awọn abajade odi-eke. Ti ọkan tabi diẹ ẹ sii awọn ẹya pataki ti adalu PCR tabi imudara imudara funrararẹ ni idinamọ tabi ni idilọwọ pẹlu, idanwo ayẹwo le jẹ idilọwọ. Eyi le ja si iṣẹ ṣiṣe ti o dinku ati paapaa awọn abajade odi eke.
Ni afikun si idinamọ, isonu ti iduroṣinṣin acid nucleic afojusun le waye nitori gbigbe ati/tabi awọn ipo ibi ipamọ ṣaaju igbaradi ayẹwo. Ni pataki, awọn iwọn otutu giga tabi ibi ipamọ ti ko pe le ja si ibajẹ awọn sẹẹli ati awọn acids nucleic. Iṣatunṣe sẹẹli ati àsopọ ati ifibọ paraffin jẹ awọn idi ti a mọ daradara ti pipin DNA ati iṣoro itẹramọṣẹ (wo Awọn nọmba 1 ati 2). Ni awọn iṣẹlẹ wọnyi, paapaa ipinya ti o dara julọ ati iwẹnumọ kii yoo ṣe iranlọwọ.

olusin 1 | Ipa ti aibikita lori iduroṣinṣin DNA
Agarose gel electrophoresis fihan pe didara DNA ti o ya sọtọ lati awọn apakan paraffin ti awọn autopsies yatọ ni riro. DNA ti o yatọ si awọn ipari ajẹkù aropin wa ninu awọn ayokuro ti o da lori ọna imuduro. DNA ti wa ni ipamọ nikan nigbati o wa titi ni awọn ayẹwo ti o tutunini abinibi ati ni formalin didoju ti a fi silẹ. Lilo ekikan Bouin fixative ti o lagbara tabi ti ko ni buffered, formalin ti o ni formic acid yorisi ipadanu pataki ti DNA. Ida ti o ku ti pin pupọ.
Ni apa osi, ipari ti awọn ajẹkù jẹ afihan ni awọn orisii kilobase (kbp)

olusin 2 | Pipadanu ti iduroṣinṣin ti awọn ibi-afẹde acid nucleic
(a) Aafo 3'-5' lori awọn okun mejeeji yoo ja si isinmi ni DNA afojusun. kolaginni ti DNA yoo si tun waye lori kekere ajeku. Bibẹẹkọ, ti aaye ifasilẹ alakoko ba sonu lori ajẹkù DNA, imudara laini nikan waye. Ninu ọran ti o dara julọ, awọn ajẹkù le tun ara wọn ṣe, ṣugbọn awọn eso yoo jẹ kekere ati isalẹ awọn ipele wiwa.
(b) Isonu ti awọn ipilẹ, nipataki nitori depurination ati dida dimer thymidine, o yori si idinku ninu nọmba H-bonds ati idinku ninu Tm. Lakoko ipele imorusi elongated, awọn alakoko yoo yo kuro lati inu DNA matrix ati pe kii yoo parẹ paapaa labẹ awọn ipo ti o lagbara.
(c) Awọn ipilẹ thymine ti o wa nitosi ṣe dimer TT kan.
Iṣoro miiran ti o wọpọ ti o maa nwaye ni awọn iwadii molikula ni itusilẹ ti o kere ju ti aipe ti awọn acids nucleic afojusun ni akawe si isediwon phenol-chloroform. Ni awọn iṣẹlẹ to gaju, eyi le ni nkan ṣe pẹlu awọn odi eke. Elo akoko le wa ni fipamọ nipa farabale lysis tabi enzymatic lẹsẹsẹ ti cell idoti, sugbon yi ọna igba àbábọrẹ ni kekere PCR ifamọ nitori insufficient nucleic acid itusilẹ.

Idilọwọ iṣẹ-ṣiṣe polymerase lakoko imudara

Ni gbogbogbo, idinamọ ni a lo bi ero inu eiyan lati ṣapejuwe gbogbo awọn okunfa ti o yori si awọn abajade PCR suboptimal. Ni ori biokemika ti o muna, idinamọ ni opin si iṣẹ ṣiṣe ti henensiamu, ie, o dinku tabi ṣe idiwọ iyipada-ọja-ọja nipasẹ ibaraenisepo pẹlu aaye ti nṣiṣe lọwọ ti DNA polymerase tabi cofactor rẹ (fun apẹẹrẹ, Mg2+ fun Taq DNA polymerase).
Awọn paati ninu ayẹwo tabi ọpọlọpọ awọn buffers ati awọn ayokuro ti o ni awọn reagents le ṣe idiwọ henensiamu taara tabi dẹkun awọn alabaṣiṣẹpọ rẹ (fun apẹẹrẹ EDTA), nitorinaa mu ṣiṣẹ polymerase ati ni ọna ti o yori si idinku tabi awọn abajade PCR odi eke.
Sibẹsibẹ, ọpọlọpọ awọn ibaraenisepo laarin awọn paati ifaseyin ati awọn acids nucleic ti o ni ibi-afẹde tun jẹ apẹrẹ bi 'awọn inhibitors PCR'. Ni kete ti iduroṣinṣin ti sẹẹli ba ni idalọwọduro nipasẹ ipinya ati acid nucleic ti tu silẹ, awọn ibaraenisepo laarin apẹẹrẹ ati ojutu agbegbe rẹ ati ipele to lagbara le waye. Fun apẹẹrẹ, 'awọn apanirun' le di ẹyọkan tabi DNA ti o ni ilopo meji nipasẹ awọn ibaraenisepo ti kii ṣe covalent ati dabaru pẹlu ipinya ati ìwẹnumọ nipa didin nọmba awọn ibi-afẹde ti o de ọdọ ọkọ oju-omi esi PCR.
Ni gbogbogbo, awọn inhibitors PCR wa ninu ọpọlọpọ awọn omi ara ati awọn reagents ti a lo fun awọn idanwo iwadii ile-iwosan (urea ninu ito, hemoglobin ati heparin ninu ẹjẹ), awọn afikun ounjẹ ounjẹ (awọn ẹya ara ẹni, glycogen, ọra, awọn ions Ca2 +) ati awọn paati ni agbegbe (phenols). , awọn irin eru)

Awọn inhibitors PCR ti o wọpọ diẹ sii ni a le rii ni awọn kokoro arun ati awọn sẹẹli eukaryotic, DNA ti kii ṣe ibi-afẹde, awọn macromolecules abuda DNA ti awọn matrices àsopọ ati ohun elo yàrá gẹgẹbi awọn ibọwọ ati awọn pilasitik. Mimu awọn acids nucleic lakoko tabi lẹhin isediwon jẹ ọna ti o fẹ julọ fun yiyọ awọn inhibitors PCR kuro.
Loni, ọpọlọpọ awọn ohun elo isediwon adaṣe le rọpo ọpọlọpọ awọn ilana afọwọṣe, ṣugbọn 100% imularada ati/tabi isọdi awọn ibi-afẹde ko ti ṣaṣeyọri rara. Awọn inhibitors ti o pọju le tun wa ninu awọn acids nucleic ti a sọ di mimọ tabi o le ti ni ipa tẹlẹ. Awọn ilana oriṣiriṣi wa lati dinku ipa ti awọn inhibitors. Yiyan ti polymerase ti o yẹ le ni ipa pataki lori iṣẹ inhibitor. Awọn ọna miiran ti a fihan lati dinku idinamọ PCR n pọ si ifọkansi polymerase tabi lilo awọn afikun bii BSA.
Idinamọ awọn aati PCR le ṣe afihan nipasẹ lilo iṣakoso didara ilana inu (IPC).
A gbọdọ ṣe itọju lati yọ gbogbo awọn reagents ati awọn solusan miiran ninu ohun elo isediwon, gẹgẹbi ethanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol ati phenol, lati ipinya acid nucleic nipasẹ igbesẹ fifọ ni kikun. Ti o da lori ifọkansi wọn, wọn le mu ṣiṣẹ tabi dojuti PCR.