Àwọn okùnfà ìdènà nínú àwọn ìṣe PCR

Nígbà tí PCR bá ń ṣe ìhùwàpadà, àwọn nǹkan kan máa ń fa ìdènà.
Nítorí pé PCR ní agbára púpọ̀, a kà ìbàjẹ́ sí ọ̀kan lára ​​àwọn ohun pàtàkì tó lè nípa lórí àwọn àbájáde PCR, ó sì lè fa àwọn àbájáde rere tí kò tọ́.
Bákan náà ni oríṣiríṣi orísun tó ń yọrí sí àwọn àbájáde èké-odi ṣe pàtàkì. Tí a bá dí ọ̀kan tàbí jù bẹ́ẹ̀ lọ lára ​​àwọn apá pàtàkì ti àdàpọ̀ PCR tàbí ìṣesí ìdàgbàsókè fúnra rẹ̀ lọ́wọ́ tàbí tí a bá dí wọn lọ́wọ́, a lè dí àyẹ̀wò àyẹ̀wò náà lọ́wọ́. Èyí lè yọrí sí ìdínkù nínú iṣẹ́ ṣíṣe àti àwọn àbájáde búburú èké pàápàá.
Yàtọ̀ sí ìdíwọ́, pípadánù ìdúróṣinṣin nucleic acid tí a fojú sí lè ṣẹlẹ̀ nítorí àwọn ipò gbigbe tàbí ìpamọ́ kí a tó ṣe àyẹ̀wò. Ní pàtàkì, ìwọ̀n otútù gíga tàbí àìtó ìpamọ́ tó lè fa ìbàjẹ́ àwọn sẹ́ẹ̀lì àti nucleic acids. Fífi sẹ́ẹ̀lì àti àsopọ àti fífi paraffin sínú ara jẹ́ àwọn ohun tí a mọ̀ dáadáa tí ó ń fa ìpínyà DNA àti ìṣòro tí ó ń bá a lọ (wo Àwòrán 1 àti 2). Nínú àwọn ọ̀ràn wọ̀nyí, ìyàsọ́tọ̀ àti ìwẹ̀nùmọ́ tí ó dára jùlọ kò ní ran lọ́wọ́.

Àwòrán 1 | Àkóbá ìdènà ara lórí ìdúróṣinṣin DNA
Elektrophoresis jeli Agarose fihan pe didara DNA ti a ya sọtọ lati awọn apakan paraffin ti awọn ara ti a ti yọ kuro yatọ si pupọ. DNA ti awọn gigun apa apapọ oriṣiriṣi wa ninu awọn iyọkuro da lori ọna fifisilẹ. A tọju DNA nikan nigbati a ba so o mọ ninu awọn ayẹwo ti o ti di didi ati ninu formalin neutral ti a fi buffered. Lilo formalin ti o ni acidic Bouin ti o lagbara tabi ti ko ni buffered, ti o ni formic acid ja si pipadanu DNA pataki. Apakan ti o ku jẹ pipin pupọ.
Ní apá òsì, a máa ń fi gígùn àwọn ègé náà hàn ní àwọn ègé kilobase pairs (kbp)

Àwòrán 2 | Pípàdánù ìdúróṣinṣin àwọn ibi-afẹ́fẹ́ nucleic acid
(a) Ààlà 3′-5′ lórí àwọn okùn méjèèjì yóò yọrí sí ìfọ́ DNA tí a fẹ́. Ìṣẹ̀dá DNA yóò sì tún wáyé lórí ègé kékeré náà. Síbẹ̀síbẹ̀, tí ibi ìfọ́ primer bá pàdánù lórí ègé DNA náà, ìfọ́pọ̀ onílà nìkan ló máa wáyé. Nínú ọ̀ràn tí ó dára jùlọ, àwọn ègé náà lè tún ara wọn ṣe, ṣùgbọ́n àwọn èso náà yóò kéré sí i, wọn yóò sì wà ní ìsàlẹ̀ àwọn ìpele ìwádìí.
(b) Pípàdánù àwọn ìpìlẹ̀, pàápàá jùlọ nítorí ìyọkúrò nínú omi àti ìṣẹ̀dá thymidine dimer, yóò yọrí sí ìdínkù nínú iye àwọn H-bonds àti ìdínkù nínú Tm. Ní àkókò ìgbóná gígùn, àwọn primers yóò yọ́ kúrò nínú matrix DNA wọn kò sì ní ṣe àtúnṣe kódà lábẹ́ àwọn ipò tí kò le koko.
(c) Àwọn ìpìlẹ̀ thymine tó wà ní ẹ̀gbẹ́ rẹ̀ máa ń ṣe TT dimer.
Iṣoro miiran ti o wọpọ ti o maa n waye ninu ayẹwo molikula ni itusilẹ nucleic acids afojusun ti ko dara ju ti o dara julọ ni akawe pẹlu yiyọkuro phenol-chloroform. Ni awọn ọran ti o buruju, eyi le ni nkan ṣe pẹlu awọn odi eke. A le fipamọ akoko pupọ nipasẹ sise lysis tabi jijẹ awọn idoti sẹẹli ti enzymatic, ṣugbọn ọna yii nigbagbogbo n fa ifamọ PCR kekere nitori pe ko to itusilẹ nucleic acid.

Idilọwọ iṣẹ polymerase lakoko imugboroja

Ni gbogbogbo, a lo idinamọ gẹgẹbi imọran apoti lati ṣalaye gbogbo awọn okunfa ti o yori si awọn abajade PCR ti ko dara julọ. Ni ọna biokemika ti o muna, idinamọ ni opin si iṣẹ ti enzyme, iyẹn ni, o dinku tabi ṣe idiwọ iyipada ọja substrate nipasẹ ibaraenisepo pẹlu aaye ti nṣiṣe lọwọ ti DNA polymerase tabi cofactor rẹ (fun apẹẹrẹ, Mg2+ fun Taq DNA polymerase).
Àwọn èròjà inú àyẹ̀wò tàbí onírúurú àwọn ohun èlò ìfàmọ́ra àti àwọn èròjà tí ó ní àwọn ohun èlò ìfàmọ́ra lè dí enzyme náà lọ́wọ́ tàbí kí wọ́n dẹkùn àwọn ohun èlò ìfàmọ́ra rẹ̀ (fún àpẹẹrẹ EDTA), nípa bẹ́ẹ̀ wọ́n lè dá polymerase náà dúró, èyí sì lè yọrí sí ìdínkù tàbí àbájáde PCR tí kò dára.
Sibẹsibẹ, ọpọlọpọ awọn ibaraenisepo laarin awọn eroja ibaraenisepo ati awọn acids nucleic ti o ni afojusun ni a tun pe ni 'awọn inhibitors PCR'. Ni kete ti a ba da iduroṣinṣin sẹẹli naa duro nipasẹ iyasọtọ ati pe a tu nucleic acid silẹ, awọn ibaraenisepo laarin ayẹwo ati ojutu ti o wa ni ayika rẹ ati ipele lile le waye. Fun apẹẹrẹ, awọn 'scavengers' le so DNA kan tabi meji-stranded nipasẹ awọn ibaraenisepo ti kii ṣe covalent ati idilọwọ ipinya ati mimọ nipa idinku nọmba awọn ibi-afẹde ti o de ọdọ ohun elo ibaraenisepo PCR ni ipari.
Ni gbogbogbo, awọn oludena PCR wa ninu ọpọlọpọ awọn omi ara ati awọn ohun elo ti a lo fun awọn idanwo iwadii ile-iwosan (urea ninu ito, hemoglobin ati heparin ninu ẹjẹ), awọn afikun ounjẹ (awọn eroja adayeba, glycogen, ọra, awọn ions Ca2+) ati awọn paati ninu ayika (phenols, awọn irin ti o wuwo)

Àwọn olùdínà PCR tó wọ́pọ̀ jùlọ ni a lè rí nínú bakitéríà àti àwọn sẹ́ẹ̀lì eukaryotic, DNA tí kìí ṣe àfojúsùn, àwọn macromolecules tí ó so DNA pọ̀ mọ́ àwọn matrices àsopọ àti àwọn ohun èlò yàrá bíi ibọ̀wọ́ àti ike. Ìwẹ̀nùmọ́ àwọn nucleic acids nígbà tàbí lẹ́yìn yíyọ wọ́n ni ọ̀nà tí a fẹ́ràn jùlọ láti yọ àwọn olùdínà PCR kúrò.
Lónìí, onírúurú ẹ̀rọ ìyọkúrò aládàáṣe lè rọ́pò ọ̀pọ̀lọpọ̀ ìlànà ọwọ́, ṣùgbọ́n a kò tíì rí ìtúnṣe àti/tàbí ìwẹ̀nùmọ́ 100% àwọn ibi-afẹ́de. Àwọn ìdènà tó ṣeéṣe lè wà nínú àwọn núkléìkì asíìdì tí a ti sọ di mímọ́ tàbí kí wọ́n ti bẹ̀rẹ̀ sí ṣiṣẹ́. Àwọn ọ̀nà ọ̀tọ̀ọ̀tọ̀ ló wà láti dín ipa àwọn ìdènà kù. Yíyan polymerase tó yẹ lè ní ipa pàtàkì lórí iṣẹ́ ìdènà. Àwọn ọ̀nà mìíràn tí a ti fìdí rẹ̀ múlẹ̀ láti dín ìdènà PCR kù ni mímú kí ìṣọ̀kan polymerase pọ̀ sí i tàbí lílo àwọn afikún bíi BSA.
A le fi idinamọ awọn aati PCR han nipa lilo iṣakoso didara ilana inu (IPC).
A gbọ́dọ̀ ṣọ́ra láti mú gbogbo àwọn ohun èlò ìfàmọ́ra àti àwọn omi míràn tí ó wà nínú ohun èlò ìyọkúrò, bí ethanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol àti phenol, kúrò nínú nucleic acid isolate nípa fífọ ara wọn dáadáa. Ó sinmi lórí bí wọ́n ṣe pọ̀ tó, wọ́n lè mú PCR ṣiṣẹ́ tàbí kí wọ́n dínà rẹ̀.